Молекулярно-биологическая диагностика

О дним из наиболее значительных достижений молекулярной биологии, удостоенным в 1995 г. Нобелевской премии, стала разработка технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР стала незаменимым инструментом в диагностике целого ряда заболеваний, и c 1994 г. все шире используется в лаборатории Республиканского Центра гематологии и трансплантации костного мозга.

Амплификация (умножение) требуемого фрагмента молекулы ДНК происходит в результате многократного воспроизведения стандартного цикла ПЦР, который включает три последовательные стадии: c помощью ПЦР можно за несколько часов размножить (амплифицировать) искомую генетическую последовательность в миллиарды раз. Это позволяет манипулировать микроколичествами образца, получать ответ за довольно короткий срок и с очень высокой чувствитель-ностью (10-5-10-7).

В лаборатории молекулярно-биологической диагностики ЦТКМ технология ПЦР используется с целью:

• выявления генетических маркеров острых и хронических лейкозов;
• диагностики вирусных инфекций;
• мониторинга гемопоэтического химеризма при аллогенной трансплантации костного мозга.

Выявление химерного BCR-ABL гена и его типов

мРНК BCR-ABL гена обнаруживается примерно у 97–98% больных ХМЛ, что позволяет поставить диагноз в тех случаях, когда цитогенетическими методами это сделать невозможно.

По нашим данным у пациентов старше 18 лет b3a2 тип BCR-ABL гена выявлялся в 30% случаев, b2a2 тип — в 43% и e1a2 тип — в 1%. Кроме того, были обнаружены также смешанные типы химерного BCR-ABL гена — b2a2 + e1a2 — в 3%, и у 1-го больного был обнаружен ранее невыявлявшийся перестройки BCR-ABL гена, который мы условно обозначили как «не b3a2, не b2a2, не e1a2».

ПЦР-диагностика вирусных инфекций

Раннее выявление вирусных инфекций у иммуносупрессивных больных (после трансплантации) с помощью ПЦР часто является методом выбора, поскольку у таких больных подавлена выработка антител и традиционный иммуноферментный анализ (ИФА) является малоинформативным. В лаборатории ЦТКМ внедрены методы ПЦР-диагностики вирусов герпеса, CMV, вирусов гепатитов и др. с помощью ПЦР, что позволяет обнаруживать до 100 или менее вирусных частиц в 1 мл образца.

Оценка гемопоэтического «Химеризма»

При аллогенной трансплантации очень важно определить — за счет каких клеток — донора или больного — восстанавливается гемопоэз. Амплификация ДНК из крови реципиента позволяет определить примесь менее 1% клеток донора и проследить динамику приживления КМ.

В данном случае донор и реципиент КМ имели отличия по аллелям ДНК-локусов CSF1PO, TРOX, THO1 и P13B. Это позволило проследить динамику приживления клеток костного мозга. Как видно из рисунка 3, на 28–45 дни возник «смешенный химеризм», когда в крови одновременно присутствуют клетки донора и больного. На 60-й день выявлялась только ДНК больного, что позволило своевременно диагностировать неприживление КМ донора.